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Premiers réactifs d'ACP de Transcriptase d'inverse du kit R1011/R1012 de synthèse du brin CDNA
Détails sur le produit:
| Lieu d'origine: | La Chine |
| Nom de marque: | GDSBio |
| Certification: | / |
| Numéro de modèle: | R1011/R1012 |
Conditions de paiement et expédition:
| Quantité de commande min: | 1box |
|---|---|
| Détails d'emballage: | le petit paquet ou le volume distribuent ou OEM |
| Délai de livraison: | jours 8work |
| Conditions de paiement: | L/C, D/A, D/P, T/T, Western Union, MoneyGram |
| Capacité d'approvisionnement: | 100 boîtes/boîtes par jour |
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Détail Infomation |
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| Chat. Non.: | R1011/R1012 | Concentration: | R1011 (20 rxns), R1012 (100 rxns) |
|---|---|---|---|
| Aspect: | sans couleur | Groupe: | Réactifs inverses d'ACP de Transcriptase |
| Activité: | Passage | Capacité d'amplification: | / |
| Logo Printing: | Avec Logo Printing | Paquet de transport: | Emballage |
| Capacité de production: | 100 boîtes/boîtes par jour | Conditions de stockage: | Magasin à -20°C |
| Surligner: | 20 réactifs inverses d'ACP de Transcriptase de rxns,100 réactifs inverses d'ACP de Transcriptase de rxns,premier kit de synthèse de cdna de brin de 20 rxns |
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Description de produit
Droite - kit d'ACP
Pour l'usage de recherches seulement
Cat No. R1011, 20 rxns
Cat No. R1012, 100 rxns
Composants du kit
| Composant | R1011 (20 rxns) | R1012 (100 rxns) |
| M-MLV (200U/μl) | μl 20 | μl 100 |
| RNasin (40U/μl) | μl 12 | μl 60 |
| (Décollement) 15 Oligo (50μM) | μl 20 | μl 100 |
| Amorce aléatoire de hexamer (50μM) | μl 20 | μl 100 |
| tampon du Premier-brin 5× | μl 80 | μl 400 |
| ddH sans RNase2 O | 1 ml | 1 ml de × 5 |
| dNTPs (10mM pièce) | μl 50 | μl 250 |
Stockage
Tous les composants du kit devraient être stockés à -20°C. gardent l'ARN de contrôle à -70°C pour un entreposage plus prolongé.
Description
Le kit de RT-PCR est optimisé pour synthétiser le cDNA de premier-brin de poly épuré (A)+ ou ARN total. Le kit de RT-PCR pour RT-PCR fournit les rendements accrus de cDNA, la sensibilité élevée, et les transcriptions intégrales dans un format commode. Vous obtenez tous les composants que vous avez besoin pour la synthèse réussie de cDNA de premier-brin, épargnant votre temps et assurant votre succès avec chaque expérience. Le kit Transcriptase inverse est une version de M-MLV droite qui a été machiné pour réduire l'activité de la RNase H et pour fournir la stabilité thermique accrue. L'enzyme est employée pour synthétiser le cDNA à une température ambiante de 42-55°C, fournissant la plus grande spécificité, les plus grands rendements de cDNA, et le produit plus intégral que d'autres transcriptases inverses.
Applications
Première synthèse de cDNA de brin pour RT-PCR
Construction des bibliothèques de cDNA
RT-PCR en une étape
Extension d'amorce
Notes importantes
Prévention de la contamination de ribonucléase
La pureté et l'intégrité d'ARN est essentielle pour la synthèse du cDNA intégral. L'ARN peut être dégradé par la RNase A, qui est un contaminant fortement stable trouvé dans n'importe quel environnement de laboratoire. Tous les composants du kit ont été rigoureusement examinés pour s'assurer qu'ils sont sans RNase. Pour empêcher la contamination l'environnement et les réactifs de laboratoire, toutes les solutions préparées doivent être exempts de RNases. Recommandations générales d'éviter la contamination de RNase :
- DEPC-festin tous les tubes et astuces de pipette à employer dans la synthèse de cDNA ou pour employer le labware sans nucléase certifié.
- Portez les gants en manipulant l'ARN et tous les réactifs, car la peau est une source commune de RNases. Gants de changement fréquemment.
- Employez les réactifs sans RNase, y compris l'eau de haute qualité (par exemple, l'eau DEPC-traitée).
- Employez un inhibiteur de RNase, tel que Dongsheng RNasin (#R2011) pour protéger l'ARN contre l'activité de RNases.
- Gardez tous les composants de kit a étroitement scellé quand non utilisable. Gardez tous les tubes s'est étroitement fermé pendant la réaction inverse de transcription.
ARN de calibre
L'ARN cellulaire total d'isolement par des méthodes standard convient pour l'usage avec le kit. L'ARN purifié doit être exempt de sels, d'ions en métal, d'éthanol et de phénol pour éviter d'empêcher la réaction de synthèse de cDNA. Des contaminants de trace peuvent être enlevés par la précipitation d'éthanol de l'ARN suivi de deux lavages du granule avec de l'éthanol froid de 75%. Pour des applications de RT-PCR, l'ARN de calibre doit être exempt de contamination d'ADN. Avant la synthèse de cDNA, l'ARN peut être préparé avec de la DNase I pour éliminer des traces d'ADN. DNase je dois être obtenu par l'utilisateur. Exécutez toujours une réaction de contrôle (Droite-sans) qui inclut tous les composants pour RT-PCR excepté l'enzyme inverse de transcriptase.
Digestion de la RNase H
La sensibilité de l'étape d'ACP peut être augmentée (particulièrement pour de longs calibres) en enlevant le calibre d'ARN du cDNA : Molécule hybride d'ARN par digestion avec de la RNase H après la synthèse de premier-brin. La présence de la RNase H pendant la synthèse de premier-brin dégradera le calibre ADN messagère, ayant pour résultat la synthèse intégrale diminuée de cDNA et les rendements diminués de cDNA de premier-brin.
Amorces
La synthèse du premier cDNA de brin peut s'amorcer avec (décollement) l'amorce 15 oligo, les amorces aléatoires ou les amorces gène-spécifiques.
(Décollement) 15 Oligo amorce la synthèse de cDNA du poly (A) présent de queue au 3' - extrémité d'ADN messagère eucaryotique. Les amorces aléatoires lancent la synthèse de cDNA de toute la population d'ARN (rRNA et ADN messagère). Par conséquent, utilisant les amorces aléatoires pour des premiers résultats de synthèse de brin dans une plus grande complexité du cDNA produit comparé (décollement) à l'amorce 15 oligo. Par conséquent, la sensibilité et la spécificité des réactions suivantes d'ACP peuvent être réduites. Cependant, il y a plusieurs applications où il est salutaire d'utiliser les amorces aléatoires, telles que la synthèse de cDNA utilisant des mRNAs sans poly (A) queue, ou synthèse de cDNA utilisant poly (A) - échantillons enrichis d'ARN.
des amorces Gène-spécifiques sont utilisées pour synthétiser le cDNA spécifique d'une piscine de l'ARN ou de l'ADN messagère total et doivent être obtenues par l'utilisateur.
D'abord - procédure de synthèse de cDNA de brin
Le premier - la réaction de cDNA de brin peut être exécutée comme réaction individuelle ou comme série de réactions parallèles avec différents calibres d'ARN. Par conséquent, le mélange de la réaction peut être préparé en combinant des réactifs individuellement ou un mélange principal contenant tous les composants excepté l'ARN de calibre peut être préparé. Selon la structure du calibre d'ARN, les étapes distinctes pour la dénaturation d'ARN et le recuit d'amorce peuvent améliorer des résultats de RT-PCR.
Protocole
I. Première synthèse de cDNA de brin
1. Ajoutez les réactifs suivants dans un tube stérile et sans nucléase sur la glace dans l'ordre indiqué :
| ARN de calibre |
poly (A) ADN messagère ou ARN spécifique |
1-5 μg |
| Amorce |
(décollement) amorce 15 oligo ou amorce aléatoire de hexamer |
1 μl 1 μl |
| l'eau DEPC-traitée | au μl 12,4 | |
| Volume total | μl 12,4 | |
2. Mélangez doucement, centrifugez brièvement et incubez à 70°C pendant 5 mn de froid sur la glace, tourner vers le bas et placer la fiole de retour sur la glace.
3. Préparez le mélange suivant de synthèse de cDNA, ajoutez les composants suivants dans l'ordre indiqué :
| tampon du premier-brin 5× | μl 4 |
| dNTPs (10 millimètres chacun) | 1 μl |
| RNasin | 0,6 μl |
| M-MLV | 1 μl |
4. Mélangez doucement et centrifugez brièvement.
5. Pour (décollement) 15 oligo, incubez pour la minute 60 à 42°C. Pour le hexamer aléatoire la synthèse amorcée, incubent pour la minute 60 à 37°C.
6. Terminez la réaction par la chauffage à 70°C pendant 5 mn.
Le produit inverse de réaction de transcription peut être employé immédiatement dans les deuxièmes réactions de synthèse de cDNA de brin ou être stocké à -20°C pour moins qu'une semaine. Pour un entreposage plus prolongé, -70°C est recommandé.
II. amplification d'ACP de premier cDNA de brin
Le produit de la première synthèse de cDNA de brin peut être employé directement dans l'ACP ou le qPCR. Le volume du premier mélange de la réaction de synthèse de cDNA de mèche ne devrait pas comporter plus de 1/10 de tout le volume de réaction d'ACP. Normalement, le μl 2 du premier mélange de la réaction de synthèse de cDNA de mèche est employé comme calibre pour l'ACP suivant dans le volume total de 50 μl.
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